การ Degas ไล่ก๊าซที่ละลายอยู่ใน Mobile Phase ของ HPLC (High Performance Liquid Chromatography) เป็นขั้นตอนสำคัญมาก เพราะก๊าซที่ละลายในตัวทำละลาย (เช่น อากาศ ซึ่งมี O₂, N₂ และ CO₂) จะทำให้เกิดปัญหาหลายอย่าง ดังนี้

1. ป้องกันการเกิดฟองอากาศ (Air Bubble) เมื่อ Mobile Phase ถูกดูดเข้าสู่ปั๊ม HPLC ที่มีแรงดันสูง ก๊าซที่ละลายอยู่จะสามารถแยกตัวออกมาเป็นฟองอากาศได้ ผลที่เกิดขึ้นคือ

• ปั๊มส่งตัวทำละลายไม่สม่ำเสมอ
• อัตราการไหล (Flow Rate) แกว่ง
• ความดัน (Pressure) ผันผวน
• Baseline ของ Detector ไม่นิ่ง

2. ป้องกัน Pump Cavitation

ถ้ามีฟองอากาศเข้าไปในหัวปั๊ม (Pump Head) จะทำให้

• ปั๊มดูด Mobile Phase ได้ไม่เต็ม
• แรงดันตก
• Flow Rate ไม่คงที่
• อายุการใช้งานของซีลและลูกสูบลดลง

3. ลดสัญญาณรบกวนของ Detector โดยเฉพาะ

• UV Detector
• PDA Detector
• Fluorescence Detector

ฟองอากาศที่ผ่าน Flow Cell จะทำให้

• Baseline Noise สูง
• Baseline Drift
• Peak เพี้ยน
• ความไวลดลง

4. เพิ่มความแม่นยำของ Retention Time เมื่อ Flow Rate คงที่ จะทำให้

• Retention Time คงที่
• Peak Area มีความแม่นยำ
• ผลการวิเคราะห์สามารถทำซ้ำได้ (Good Reproducibility)

5. ลดการเกิดฟองขณะผสม Mobile Phase โดยเฉพาะระบบ

• Binary Gradient
• Quaternary Gradient

หาก Mobile Phase มีแก๊สละลายอยู่มาก
เมื่อผสมสารละลายต่างชนิดเข้าด้วยกัน ความสามารถในการละลายก๊าซจะเปลี่ยน ทำให้เกิดฟองอากาศได้ง่าย

วิธี Degas ที่นิยม

 ถ้าไม่ Degas จะเกิดอะไรขึ้น?

อาการที่พบได้บ่อย ได้แก่

• ความดันขึ้น ๆ ลง ๆ
• Baseline ไม่นิ่ง
• มี Noise มาก
• Peak แตกหรือผิดรูป
• Retention Time เปลี่ยน
• ปั๊มมีเสียงดังหรือสูบไม่ต่อเนื่อง
• เครื่องขึ้น Error เช่น Low Pressure, Pump Error, หรือ Prime Required

สรุป

การ Degas Mobile Phase มีวัตถุประสงค์หลักเพื่อ กำจัดก๊าซที่ละลายในตัวทำละลาย ก่อนเข้าสู่ระบบ HPLC ซึ่งช่วยให้:

• ปั๊มทำงานได้อย่างเสถียร
• ไม่มีฟองอากาศในระบบ
• ความดันและอัตราการไหลคงที่
• Detector ให้สัญญาณที่นิ่งและมี Noise ต่ำ
• ผลการวิเคราะห์มีความแม่นยำและทำซ้ำได้ดี

ระยะเวลาในการ Degas Mobile Phase ขึ้นอยู่กับวิธีที่ใช้ ปริมาตรของตัวทำละลาย และชนิดของตัวทำละลาย ดังนี้

คำแนะนำสำหรับห้องปฏิบัติการ

• Mobile Phase ปริมาตร 500 mL: ใช้ Ultrasonic Bath ประมาณ 10–15 นาที
• Mobile Phase ปริมาตร 1 L: ใช้ Ultrasonic Bath ประมาณ 15–20 นาที
• หากใช้ Ultrasonic Bath ร่วมกับการดูดสุญญากาศ มักใช้เวลาเพียง 10–15 นาที ก็เพียงพอ

ข้อควรระวัง

• ไม่ควร Sonicate นานเกิน 30 นาที โดยเฉพาะตัวทำละลายอินทรีย์ที่ระเหยง่าย เช่น Methanol หรือ Acetonitrile เพราะอาจทำให้ตัวทำละลายระเหยและองค์ประกอบของ Mobile Phase เปลี่ยนไป
• หลังจาก Degas แล้ว ควรปิดฝาขวดให้แน่นเพื่อลดการดูดซับอากาศกลับเข้าสู่สารละลาย
• หากใช้ Gradient ที่มีตัวทำละลายอินทรีย์สูง ควรเตรียม Mobile Phase ใหม่เป็นระยะ เพื่อรักษาความสม่ำเสมอขององค์ประกอบ

หากเครื่อง HPLC มี Online Degasser

ในเครื่อง HPLC รุ่นใหม่จากผู้ผลิต เช่น Agilent, Waters, Shimadzu หรือ Thermo Fisher ที่ติดตั้ง Online Degasser มาในตัว โดยทั่วไป ไม่จำเป็นต้อง Degas ด้วย Ultrasonic Bath ทุกครั้ง เพราะระบบจะกำจัดก๊าซขณะเครื่องทำงาน อย่างไรก็ตาม การ Sonicate สั้น ๆ (ประมาณ 5–10 นาที) ก่อนใช้งานยังอาจช่วยลดฟองอากาศในกรณีที่เพิ่งผสม Mobile Phase ใหม่หรือมีตัวทำละลายที่ละลายก๊าซได้มาก

สำหรับการ Degas Mobile Phase ของ HPLC ด้วย Ultrasonic Bath พารามิเตอร์ที่สำคัญคือ ความถี่ (Frequency) มากกว่ากำลังไฟ (Power) เพราะความถี่เป็นตัวกำหนดลักษณะการเกิด Cavitation ซึ่งช่วยให้ก๊าซที่ละลายอยู่หลุดออกจากตัวทำละลาย

1. ความถี่ (Frequency)

เครื่อง Ultrasonic Bath ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่มีความถี่อยู่ในช่วง

• 35–40 kHz → เป็นค่ามาตรฐานและเหมาะสมที่สุดสำหรับการ Degas Mobile Phase
• 40–45 kHz → นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ทั่วไป
• 68–80 kHz → ให้ฟอง Cavitation ขนาดเล็กกว่า เหมาะกับการทำความสะอาดชิ้นงานละเอียด แต่ไม่ได้ช่วย Degas ดีกว่าอย่างมีนัยสำคัญ

ดังนั้น 40 kHz ถือเป็นค่าที่พบได้บ่อยที่สุดและเพียงพอสำหรับงาน HPLC

2. กำลัง (Ultrasonic Power) กำลังของเครื่องขึ้นกับขนาดอ่าง

สำหรับการ Degas Mobile Phase ไม่จำเป็นต้องใช้กำลังสูงสุด เพราะกำลังที่สูงเกินไปอาจทำให้ตัวทำละลายอุ่นขึ้นและระเหยได้ โดยเฉพาะ Acetonitrile และ Methanol

โดยทั่วไปกำลังประมาณ 80–150 W สำหรับอ่างขนาดเล็กถึงกลางก็เพียงพอ

3. ระยะเวลาที่เหมาะสม

• Mobile Phase 500 mL → 10–15 นาที
• Mobile Phase 1 L → 15–20 นาที

หากอุณหภูมิของน้ำในอ่างสูงเกิน 30–35°C ควรเปลี่ยนน้ำหรือพักเครื่องก่อนใช้งานต่อ

4. แนวทางที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ HPLC

ค่าที่นิยมใช้มากที่สุดคือ

• Frequency: 40 kHz
• Power: 100–150 W
• เวลา: 10–15 นาที
• จากนั้นกรองผ่านเมมเบรน 0.22 µm หรือ 0.45 µm (ตามวิธีวิเคราะห์) แล้วนำไปใช้งานทันที

ข้อควรระวัง

หากเครื่อง HPLC ของคุณมี Online Degasser (Vacuum Degasser) อยู่แล้ว การ Sonicate มีจุดประสงค์หลักเพื่อช่วยกำจัดฟองอากาศที่เกิดขึ้นระหว่างการผสม Mobile Phase เท่านั้น จึงไม่ควร Sonicate นานเกิน 20–30 นาที เพราะอาจทำให้ตัวทำละลายระเหยและเปลี่ยนสัดส่วนของ Mobile Phase ได้ โดยเฉพาะเมื่อใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ที่ระเหยง่าย เช่น Acetonitrile หรือ Methanol.

ระดับน้ำใน Ultrasonic Bath มีผลต่อประสิทธิภาพของการส่งผ่านคลื่นอัลตราโซนิกและการเกิด Cavitation ดังนั้นการเติมน้ำให้เหมาะสมจึงสำคัญมาก

ระดับน้ำที่แนะนำ

โดยทั่วไปควรเติมน้ำให้อยู่ที่

• ระดับที่ผู้ผลิตกำหนด (Water Level Mark หรือ Fill Line) ซึ่งมักอยู่ที่ ประมาณ 2/3–3/4 ของความสูงอ่าง
• เมื่อนำขวด Mobile Phase วางลงในอ่างแล้ว ระดับน้ำควรสูงกว่าระดับของตัวทำละลายในขวด หรืออย่างน้อยใกล้เคียงกับระดับตัวทำละลาย เพื่อให้พลังงานอัลตราโซนิกส่งผ่านได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ตัวอย่าง

หากใช้ขวดแก้วขนาด 1 L บรรจุ Mobile Phase 1 L

• ระดับตัวทำละลายในขวดจะอยู่ประมาณ 18–20 cm (ขึ้นกับรูปทรงขวด)
• ควรเติมน้ำในอ่างให้สูงใกล้เคียงกับระดับนี้ แต่ ไม่สูงจนเสี่ยงล้นเมื่อเปิดเครื่องหรือเมื่อวางขวดลง

หากระดับน้ำไม่เหมาะสม

น้ำน้อยเกินไป

• Cavitation เกิดไม่เต็มที่
• ประสิทธิภาพการ Degas ลดลง
• เครื่องอาจเกิดความร้อนสูง
• อายุของทรานสดิวเซอร์ (Transducer) ลดลง

น้ำมากเกินไป

• ประสิทธิภาพการส่งคลื่นอาจลดลง
• เสี่ยงน้ำล้นเมื่อวางขวด
• อาจเกิดการกระเด็นเข้าปากขวดหากปิดฝาไม่ดี

คำแนะนำสำหรับการ Degas Mobile Phase

1. เติมน้ำในอ่างตาม Water Level Mark
2. วางขวด Mobile Phase โดย ไม่ให้ก้นขวดสัมผัสก้นอ่างโดยตรง ควรวางบนตะแกรงหรือชั้นรองที่มาพร้อมเครื่อง เพราะการวางติดก้นอ่างอาจสะท้อนคลื่นและทำให้ประสิทธิภาพลดลง รวมทั้งเพิ่มความเสี่ยงต่อการแตกร้าวของขวด
3. ระดับน้ำควรอยู่ ใกล้เคียงหรือสูงกว่าระดับตัวทำละลายในขวดเล็กน้อย
4. ใช้น้ำสะอาด (DI หรือ RO) และเปลี่ยนน้ำเป็นระยะ เนื่องจากน้ำที่สกปรกหรือมีฟองมากจะลดประสิทธิภาพของ Cavitation

แนวปฏิบัติในห้องปฏิบัติการ

สำหรับการเตรียม Mobile Phase ปริมาตร 500 mL–1 L มักใช้อ่าง Ultrasonic ขนาด 3–6 L โดยเติมน้ำให้อยู่ที่ ประมาณ 70–80% ของความจุอ่าง (หรือที่ขีดระดับของผู้ผลิต) ซึ่งเป็นระดับที่ให้ประสิทธิภาพการ Degas ดีและปลอดภัยต่อเครื่องมือ.

การเลือกใช้ชนิดและขนาดรูพรุน ของ membrane filter สำหรับกรอง LCMS HPLC mobile phase

การเลือก Membrane Filter สำหรับกรอง Mobile Phase ของ HPLC และ LC-MS มี 2 ปัจจัยหลักที่ต้องพิจารณา คือ

1. วัสดุของเมมเบรน (Membrane Material)
2. ขนาดรูพรุน (Pore Size)

การเลือกที่เหมาะสมจะช่วยลดการอุดตันของระบบ ลดค่า Back Pressure และลดการปนเปื้อนที่อาจรบกวนการวิเคราะห์ โดยเฉพาะใน LC-MS

1. การเลือกวัสดุของ Membrane Filter

 2. การเลือกขนาดรูพรุน (Pore Size)

 คำแนะนำ

• HPLC ทั่วไป → ใช้ 0.45 µm
• UHPLC (อนุภาคคอลัมน์ ≤2 µm) → ใช้ 0.22 µm
• LC-MS → แนะนำ 0.22 µm เพื่อลดอนุภาคที่อาจทำให้หัวพ่น (ESI source) หรือระบบอุดตัน

3. ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของแผ่นกรอง

 สำหรับการเตรียม Mobile Phase ปริมาณ 1 ลิตร นิยมใช้ 47 mm membrane filter กับชุดกรองแบบสุญญากาศ (Vacuum Filtration)

4. คำแนะนำสำหรับ Mobile Phase ที่ใช้บ่อย

 5. สำหรับ LC-MS ควรเลือกอย่างไร

LC-MS มีความไวสูงมาก จึงควรเลือกเมมเบรนที่

• มี Low Extractables (ปล่อยสารปนเปื้อนต่ำ)
• ไม่ปล่อยสาร Plasticizer
• ไม่เกิด Ion Suppression

วัสดุที่นิยมคือ

• Hydrophilic PTFE ⭐⭐⭐⭐⭐
• PVDF ⭐⭐⭐⭐⭐
• Regenerated Cellulose (RC) ⭐⭐⭐⭐☆
• PES ⭐⭐⭐⭐☆

โดยทั่วไปจะ หลีกเลี่ยง Cellulose Acetate สำหรับ LC-MS เพราะอาจปล่อยสารชะออกได้มากกว่าเมื่อเทียบกับวัสดุข้างต้น

 สรุปคำแนะนำ

แนวปฏิบัติที่ใช้กันมากที่สุดในห้องปฏิบัติการ LC-MS ปัจจุบัน คือใช้ Hydrophilic PTFE ขนาด 0.22 µm สำหรับกรอง Mobile Phase ทุกชนิด (ทั้งที่เป็นน้ำล้วนและผสมน้ำกับ Acetonitrile หรือ Methanol) เนื่องจากมีความเข้ากันได้กับตัวทำละลายหลากหลายชนิด ให้สารชะออกต่ำ และเหมาะกับการวิเคราะห์ที่ต้องการความไวสูง เช่น LC-MS/MS